Activitat. Diagnosi molecular de la Fibrosi quística (les proves de DNA)
Estudiant la
seqüència de DNA normal i DNA de pacients amb fibrosi quística, s'ha posat de
manifest que la mutació més freqüent és la delecció de tres parells de bases
que codifiquen un únic aminoàcid (la fenilalanina) que es perd en el producte
gènic dels pacients amb aquesta malaltia.
Aquesta delecció,
coneguda amb el nom de ΔF 508, està present en la major part dels malalts de
fibrosi quística, però la seva freqüència varia en diferents zones
geogràfiques, així es troba en el 69 per cent dels cromosomes estudiats dels
països nòrdics i el Canadà i en el 50 per cent en les zones mediterrànies. En
la resta dels pacients es troben altres mutacions del gen. Avui dia es coneixen
més de 1800 i encara moltes són desconegudes.
Com ja sabem, després de l'exploració sistemàtica de
la sang de nadons que es fa en el nostre país, en aquells casos en els quals s'han
trobat valors elevats de tripsina, es realitzarà un Test diagnòstic (diagnostic
testing) per tal de confirmar o rebutjar el diagnòstic.
![]() |
|
La figura mostra la mutació més freqüent causant de la
fibrosi quística. Consisteix en la supressió de tres nucleòtids. |
1ª Part: Obtenció de DNA
En primer lloc necessitarem obtenir DNA del nadó.
Podeu fer una extracció virtual de DNA a:
![]() |
DNA EXTRACTION VIRTUAL LAB Learn.GeneticTM |
![]() |
Feu-la i, a continuació, completeu un diagrama de fluix
com el següent: |
![]() |
Ara ja heu obtingut el DNA del nadó, però en teniu molt
poc, per poder treballar necessiteu molta més quantitat de DNA. Podeu obtenir
còpies del DNA utilitzant una PCR.
PCR són les sigles en anglès de Polymerase Chain
Reaction (Reacció en cadena de la
polimerasa).
![]() |
Feu una PCR virtual i escriviu
una descripció de tot el que passa durant el procés: |
![]() |
PCR VIRTUAL LAB Learn.GeneticTM |
Utilitzant la tècnica de la PCR ja heu obtingut un
fragment del DNA del cromosoma 7 del nadó que conté precisament l'exó on es
localitza la més freqüent de les mutacions que poden causar la fibrosi
quística.
Caaataagaatatacacttctgcttaggatgataattggaggcaagtgaatcctgagcgtgatttgataatgacctaataatgatgggttttatttccagacttcacttctaatggtgattat gggagaactggagccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcatctttggtgtttcctatga tgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcatgccaactagaagaggtaagaaactatgtgaaaactttttgattatgcatatgaacccttcacactacccaaattatatatttggctccat attcaatcggttagtctacatata |
![]() |
Expliqueu com tot i que vam obtenir el DNA complert de
les cèl·lules del nadó, hem acabant tenint moltes còpies de, precisament,
aquest fragment. |
2ª part: visualització del DNA per electroforesi
L'electroforesi en gel és un procés que permet separar
molècules o fragments de molècules segons la seva mida. Així doncs, s'utilitza
habitualment per a veure els fragments de DNA que s'han amplificat amb la PCR i comprovar que tenen la
mida esperada.
![]() |
Simuleu la realització d'una electroforesi i feu un diagrama de fluix
explicant què feu i per què ho feu: |
![]() |
GEL ELECTROPHORESIS VIRTUAL LAB Learn.GeneticTM |
![]() |
3ª part: Identificació de la mutació a través de la PCR i l'electroforesi
Combinant la
tècnica de PCR i l'electroforesi es pot identificar la presència o no
d'una mutació. Cal tenir en compte que, en la PCR, els encebadors
s'uneixen específicament a una seqüència del DNA. Com ja hem vist, els
resultats de la PCR els podem veure a través d'una electroforesi.
Com dissenyaríeu un experiment que permetés saber si un individu té la
mutació per a la fibrosi quística cominant la tècnica de PCR i la de
l'electroforesi? Per a fer l'experiment disposeu de la mostra de DNA de
l'individu en qüestió, tots els reactius necessaris per a fer la PCR i
el gel d'electroforesi i la següent llista de parelles d'encenbadors,
entre els quals aheureu d'escollir el més adequat:
Parelles d'encebadors:
Parella 1 5'-catctttggtgtttc -3' 3'-caatcagatgtatat-5' |
Parella 2 5'-cattggtgtttccta-3' 3'-caatcagatgtatat-5' |
Parella 3 5'-caaataagaatata-3' |
Parella 4 5'-ctatgatgaatatag-3' |
![]() |
Per a dissenyar l'experiment, us ajudarà respondre abans les següents preguntes: |
1. Seleccioneu la parella d'encebadors que utilitzaríeu per fer la PCR i expliqueu perquè?
Per respondre, utilitzeu el processador de texts Word i
les seves eines. Fent servir la funció de Word
"buscar" i "reemplazar", identificareu el lloc del DNA on començarà a
copiar un encebador determinat i el substituireu
per la mateixa seqüència però amb un salt de línia davant .
Fixeu-vos que esteu representant el mateix procés que te lloc en una PCR. Noteu també la llargada dels diferents fragments de DNA que eventualment obtindreu.
- Creeu un document word i copieu els dos fragments següents de DNA, el que no té la mutació i el que sí
(fixeu-vos que son els fragments -mutat o no- que haurem obtingut amb la PCR).
Normal
(5') aaataagaatatacacttctgcttaggatgataattggaggcaagtgaatcctgagcgtgatttgataatgacctaataatgatgggttttatttccagacttcacttctaatggtgattatgggagaactggag
ccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcatctttggtgtttcctatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaag
catgccaactagaagaggtaagaaactatgtgaaaactttttgattatgcatatgaacccttcacactacccaaattatatatttggctccatattcaatcggttagtctacatata (3')Mutat
(5')caaataagaatatacacttctgcttaggatgataattggaggcaagtgaatcctgagcgtgatttgataatgacctaataatgatgggttttatttccagacttcacttctaatggtgattatgggagaactggag
ccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcattggtgtttcctatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcat
gccaactagaagaggtaagaaactatgtgaaaactttttgattatgcatatgaacccttcacactacccaaattatatatttggctccatattcaatcggttagtctacatata(3')
- Cliqueu en l'opció "buscar y reemplazar" del menú Edición.
- Escriviu la seqüència de l'encebador en
"buscar" (escriviu en minúscules).
- Escriviu en "reemplazar" la seqüència de reconeixement, ara en
majúscules(GTCTAC), però abans, inseriu l'opció "salto de línea manual".
Això forçarà un canvi de línia allà on se suposa que l'encebador comença a
copiar.
- Cliqueu "Reemplazar" i "Cerrar" per tancar la finestra "buscar y reemplazar".
- Començant per les lletres majúscules del text, seleccioneu amb el
cursor tot el text fins arribar al final (aneu amb compte de no
seleccionar l'espai!).
- Seleccioneu l'opció "contar palabras" en el menú "herramientas". Indiqueu el nombre de caràcters en el text seleccionat.
- Seleccioneu cada fragment obtingut en fer la PCR amb els diferents
encebadors i procediu de la mateixa manera per tal de comptar el nombre de
bases de cada fragment.
Noteu que aquestes xifres representen les mides dels fragments produïts amplificant fragments de DNA amb cadascun dels encebadors.
2. Quin encebador triaríeu? Per què?
3. Quina banda esperaríeu veure en el gel d'electroforesi amb aquest encebador en el cas que l'individu tingués la mutació? I si no al tingués?
4.Suposant que la mostra analitzada contenia la mutació, quines bandes esperaríeu veure si es fes la PCR amb la resta dels encebadors?