Activitat. Diagnosi molecular de la Fibrosi quística (les proves de DNA)




Estudiant la seqüència de DNA normal i DNA de pacients amb fibrosi quística, s'ha posat de manifest que la mutació més freqüent és la delecció de tres parells de bases que codifiquen un únic aminoàcid (la fenilalanina) que es perd en el producte gènic dels pacients amb aquesta malaltia.

Aquesta delecció, coneguda amb el nom de ΔF 508, està present en la major part dels malalts de fibrosi quística, però la seva freqüència varia en diferents zones geogràfiques, així es troba en el 69 per cent dels cromosomes estudiats dels països nòrdics i el Canadà i en el 50 per cent en les zones mediterrànies. En la resta dels pacients es troben altres mutacions del gen. Avui dia es coneixen més de 1800 i encara moltes són desconegudes.

Com ja sabem, després de l'exploració sistemàtica de la sang de nadons que es fa en el nostre país, en aquells casos en els quals s'han trobat valors elevats de tripsina, es realitzarà un Test diagnòstic (diagnostic testing) per tal de confirmar o rebutjar el diagnòstic.

 




La figura mostra la mutació més freqüent causant de la fibrosi quística. Consisteix en la supressió de tres nucleòtids.

Comproveu les conseqüències en la seqüència d'aminoàcids de la proteïna resultant utilitzant el codi genètic.

 

 

1ª Part: Obtenció de DNA


En primer lloc necessitarem obtenir DNA del nadó. Podeu fer una extracció virtual de DNA a:

  DNA EXTRACTION VIRTUAL LAB
Learn.GeneticTM

 


Feu-la i, a continuació, completeu un diagrama de fluix com el següent:

 



 


Ara ja heu obtingut el DNA del nadó, però en teniu molt poc, per poder treballar necessiteu molta més quantitat de DNA. Podeu obtenir còpies del DNA utilitzant una PCR.

PCR són les sigles en anglès de Polymerase Chain Reaction (Reacció en cadena de la polimerasa).

Feu una PCR virtual i escriviu una descripció de tot el que passa durant el procés:

 


  PCR VIRTUAL LAB
Learn.GeneticTM


Utilitzant la tècnica de la PCR ja heu obtingut un fragment del DNA del cromosoma 7 del nadó que conté precisament l'exó on es localitza la més freqüent de les mutacions que poden causar la fibrosi quística.

Caaataagaatatacacttctgcttaggatgataattggaggcaagtgaatcctgagcgtgatttgataatgacctaataatgatgggttttatttccagacttcacttctaatggtgattat
gggagaactggagccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcatctttggtgtttcctatga
tgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcatgccaactagaagaggtaagaaactatgtgaaaactttttgattatgcatatgaacccttcacactacccaaattatatatttggctccat
attcaatcggttagtctacatata

 

Expliqueu com tot i que vam obtenir el DNA complert de les cèl·lules del nadó, hem acabant tenint moltes còpies de, precisament, aquest fragment.







2ª part: visualització del DNA per electroforesi

L'electroforesi en gel és un procés que permet separar molècules o fragments de molècules segons la seva mida. Així doncs, s'utilitza habitualment per a veure els fragments de DNA que s'han amplificat amb la PCR i comprovar que tenen la mida esperada.

Simuleu la realització d'una electroforesi i feu un diagrama de fluix explicant què feu i per què ho feu:


 

  GEL ELECTROPHORESIS VIRTUAL LAB
Learn.GeneticTM

 




3ª part: Identificació de la mutació a través de la PCR i l'electroforesi

Combinant la tècnica de PCR i l'electroforesi es pot identificar la presència o no d'una mutació. Cal tenir en compte que, en la PCR, els encebadors s'uneixen específicament a una seqüència del DNA. Com ja hem vist, els resultats de la PCR els podem veure a través d'una electroforesi.

Com dissenyaríeu un experiment que permetés saber si un individu té la mutació per a la fibrosi quística cominant la tècnica de PCR i la de l'electroforesi? Per a fer l'experiment disposeu de la mostra de DNA de l'individu en qüestió, tots els reactius necessaris per a fer la PCR i el gel d'electroforesi i la següent llista de parelles d'encenbadors, entre els quals aheureu d'escollir el més adequat:


Parelles d'encebadors:

Parella 1

5'-catctttggtgtttc -3'

3'-caatcagatgtatat-5'

       

Parella 2

5'-cattggtgtttccta-3'

3'-caatcagatgtatat-5'

       

Parella 3

5'-caaataagaatata-3'

3'-caatcagatgtatat-5'
       

Parella 4

5'-ctatgatgaatatag-3'

3'-caatcagatgtatat-5'



Per a dissenyar l'experiment, us ajudarà respondre abans les següents preguntes:



 

1. Seleccioneu la parella d'encebadors que utilitzaríeu per fer la PCR i expliqueu perquè?


Per respondre, utilitzeu el processador de texts Word i les seves eines. Fent servir la funció de Word "buscar" i "reemplazar", identificareu el lloc del DNA on començarà a copiar un encebador determinat i el substituireu per la mateixa seqüència però amb un salt de línia davant .

Fixeu-vos que esteu representant el mateix procés que te lloc en una PCR. Noteu també la llargada dels diferents fragments de DNA que eventualment obtindreu.

  1. Creeu un document word i copieu els dos fragments següents de DNA, el que no té la mutació i el que sí (fixeu-vos que son els fragments -mutat o no- que haurem obtingut amb la PCR).

    Normal

    (5') aaataagaatatacacttctgcttaggatgataattggaggcaagtgaatcctgagcgtgatttgataatgacctaataatgatgggttttatttccagacttcacttctaatggtgattatgggagaactggag
    ccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcatctttggtgtttcctatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaag
    catgccaactagaagaggtaagaaactatgtgaaaactttttgattatgcatatgaacccttcacactacccaaattatatatttggctccatattcaatcggttagtctacatata
    (3')

     

    Mutat

    (5')caaataagaatatacacttctgcttaggatgataattggaggcaagtgaatcctgagcgtgatttgataatgacctaataatgatgggttttatttccagacttcacttctaatggtgattatgggagaactggag
    ccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcattggtgtttcctatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcat
    gccaactagaagaggtaagaaactatgtgaaaactttttgattatgcatatgaacccttcacactacccaaattatatatttggctccatattcaatcggttagtctacatata
    (3')

  1. Cliqueu en l'opció "buscar y reemplazar" del menú Edición.

  2. Escriviu la seqüència de l'encebador en "buscar" (escriviu en minúscules).

  3. Escriviu en "reemplazar" la seqüència de reconeixement, ara en majúscules(GTCTAC), però abans, inseriu l'opció "salto de línea manual". Això forçarà un canvi de línia allà on se suposa que l'encebador comença a copiar.

  4. Cliqueu "Reemplazar" i "Cerrar" per tancar la finestra "buscar y reemplazar".

  5. Començant per les lletres majúscules del text, seleccioneu amb el cursor tot el text fins arribar al final (aneu amb compte de no seleccionar l'espai!).

  6. Seleccioneu l'opció "contar palabras" en el menú "herramientas". Indiqueu el nombre de caràcters en el text seleccionat.

  7. Seleccioneu cada fragment obtingut en fer la PCR amb els diferents encebadors i procediu de la mateixa manera per tal de comptar el nombre de bases de cada fragment.


    Noteu que aquestes xifres representen les mides dels fragments produïts amplificant fragments de DNA amb cadascun dels encebadors.



2. Quin encebador triaríeu? Per què?


3. Quina banda esperaríeu veure en el gel d'electroforesi amb aquest encebador en el cas que l'individu tingués la mutació? I si no al tingués?


4.Suposant que la mostra analitzada contenia la mutació, quines bandes esperaríeu veure si es fes la PCR amb la resta dels encebadors?




 

CDEC. Projecte Biologia en Context. Coordinació: Silvia Lope. Edició: Roger Pruñonosa.